NY_T 2744-2015 马铃薯纺锤块茎类病毒检测 核酸斑点杂交法
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ID： |
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文件大小(MB)： |
0.48 |
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8 |
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日期： |
2024-8-14 |
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ICS 65.020,B 16 NY,中华人民共和国农业行业标准,NY/T 2744—2015,马铃薯纺锤块茎类病毒检测,核酸斑点杂交法,Detection of potato spindle tuber viroid (PSTVd)—,Nucleic acid spot hybridization (NASH),2015-05-21 发布2015-08-01 实施,中华人民共和国农业部 发布,ny/t 2744—2015,—1— 刖 a,本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草,本标准由农业部种植业管理司提出并归口,本标准起草单位:农业部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心（哈尔滨）、中国农业科学院植物保,护研究所、黑龙江八一农垦大学,本标准主要起草人:邱彩玲、刘尚武、张志想、吕典秋、白艳菊、李世访、王绍鹏、魏琪、董学志、耿宏,伟、万书明、金光辉、高艳玲、郭梅、闵凡祥、王亚洲、杨光辉、王晓丹、申宇、张威、范国权、张抒、宿飞飞、李,勇、胡林双、马纪、刘振宇、高云飞、杨帅、李学湛,I,NY/T 2744—2015,马铃薯纺锤块茎类病毒检测核酸斑点杂交法,1范围,本标准规定了马铃薯纺锤块茎类病毒（Potato Spindle Tuber Viroid, PSTVd）的检测方法,本标准适用于马铃薯的马铃薯纺锤块茎类病毒的检测,2规范性引用文件,下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文,件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件,GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法,GB 7331马铃薯种薯产地检疫规程,GB 18133马铃薯种薯,NY/T 1962—2010马铃薯纺锤块茎类病毒检测,3原理,经过标记的PSTVd探针通过氢键与其互补的靶序列结合,洗去未结合的游离探针后,经放射自显,影或显色反应检测特异结合的探针,鉴定马铃薯组织是否感染PSTVd,4试剂与材料,以下所用试剂,除特别注明者外均为分析纯试剂,水为符合GB/T 6682中规定的ー级水,4. 1 CHCk（三氯甲烷）,4.2正电荷尼龙膜（Hybond-N+）,4. 3 抗地高辛-AP（Anti-Digoxigenin-AP）,4.4 CDP-Star （化学发光法使用）,4.5 X光片（化学发光法使用）,4. 6显影液、定影液（化学发光法使用）,4.7 Tween-20（C58Hu4026,聚氧乙烯去山梨醇单月桂酸酯）,4.8 杂交液。市售,4.9 lox阻断液。市售,4. 10提取缓冲液。在160. 0 mL蒸储水中依次加入NaCl 11. 7 g,MgCl2 0. 4 g、醋酸钠（CH3coONa）,8. 21 g、无水乙醇 40. 0 mL 和十二烷基磺酸钠（Sodium Dodecyl Sulfate,SDS） 6. 0 g,用 HC! 或 NaOH,调节pH至6.0,4. 11 20倍柠檬酸缓冲液储备液（20XSSC储备液）。在800 mL水中加入NaCl 175.3 g、柠檬酸钠,88. 2 g,加入数滴!0 mol/L NaOH溶液调节pH至?. 〇,加水定容至1 L,分装后高压灭菌。或者选择市,售商品,4. 12 10% SDS。在80 mL水中加入SDS 10 g,溶解后定容至100 mL,4. 13 2XSSC/0.1 % SDSO在35. 6 mL蒸储水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液（4. 11） 4 mL, 10%,SDS（4. 12）400 rL,混匀,4. 14 0.1 XSSC/0.1 % SDSo在39. 4 mL蒸谓水中加入20倍柠檬酸缓冲液储备液（4. 11）200 “」,NY/T 2744—2015,10% SDS(4. 12)400 kL混匀,4. 15马来酸缓冲液。在800 mL水中加入马来酸(顺丁烯二酸,QH404 )11. 607 g,NaCl 8.77 g,用,NaOH调pH至7. 5(20℃),定容至1 L,5℃.25℃稳定,4. 16洗涤缓冲液。在100mL马来酸缓冲液(4.15)中加入0.3mLTween-20(4.7),混匀,5℃.25℃,稳定,4. 17 5X检测缓冲液。在 80 mL水中加入 Tris-HC1 7.88 g,NaCl 2. 92 g,用 HC1 或 NaOH 调节 pH,至9. 5(20℃),定容至100 mL0使用时用水稀释至1义工作液,5℃.25℃稳定,4. 18探针。参考吕典秋0或其他相关文献制备,或直接购买商品化的探针,4. 19阻断液。用马来酸缓冲液(4. 15)稀释10X阻断液(4. 9),制成IX工作液。如:2 mLi0X阻断液,+ 18 mL马来酸缓冲液,现用现配,4.20 抗体液工作液。每次使用前,需要10 000 r/min离心抗Dig-AP(4. 3) 5 min,从表面小心吸取,所需的量,用阻断液按1 ： 5 000稀释抗体液。例如:2 HL抗Dig-AP+10mL阻断液(4.9),2℃.8℃保,存,12h稳定,4.21 二甲基甲酰胺(C3H7N(),DMF),4. 22硝基蓝四氮嘎(C4。H3。N1。O6?2C1,NBT)储备液(化学显色法使用)。NBT 30 mg+DMF 70%,lmL,4℃或ー20℃保存备用,4. 23对甲苯胺蓝(BCIP)储备液(化学显色法使用)。BCIP 15 mg+DMF 100% 1 mL,4℃或ー20℃保,存备用,4. 24显色液(化学显色法使用)。加NBT储液(4. 22)和BCIP储液(4. 23)各……
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